乳制品中A2 β-酪蛋白的检测技术

近年来，标榜含有A2 β-酪蛋白（简称CN）的乳制品（通常被称为A2乳制品，例如“A2牛奶”和“A2奶粉”）价格远高于同类标准产品。A2 β-酪蛋白的存在已成为乳制品质量的关键指标。然而，目前尚无任何国家制定A2乳制品的标准，这给监管带来了挑战。

牛奶的基本成分

乳制品包括液态奶，例如牛奶、羊奶和骆驼奶，以及它们的制品。乳制品是指主要以奶为原料，通过加热、干燥、冷冻或发酵等工艺制成的各种液态或固态食品。由于牛奶已成为我们日常生活中不可或缺的营养饮品，本文将介绍牛奶的基本成分。

牛奶由水和干物质组成。干物质包括脂肪、蛋白质、乳糖、无机盐等。各成分的比例通常如下：

• 水分：85.5%-89.5%（平均87.5%）；
• 脂肪：2.5%-6.0%（平均3.9%）；
• 蛋白质：2.9%-5.0%（平均3.4%）；
• 乳糖：3.6%-5.5%（平均4.8%）；
• 无机盐：0.6%-0.9%（平均0.8%）；

其他：微量元素、维生素、胆固醇等。

普通牛奶中的总乳固体含量，或去除水分后的“干物质”，代表了牛奶的营养价值。其含量通常在 10.5% 到 14.5% 之间，可以使用弗莱士曼公式计算：
T = 0.25L+1.2F±K

在哪里：

• T - 总乳固体（%）；
• L - 牛奶密度（g/mL）；
• F - 脂肪（%）；
• K 系数（根据当地测试确定；中国的标准为 0.14）。
  
  值得注意的是，牛奶和羊驼奶中的蛋白质都是完全蛋白质，包含所有必需氨基酸。与母乳相比，牛奶的乳糖和低聚糖含量较低，但酪蛋白和矿物质含量较高。牛奶的蛋白质含量也远高于母乳（见图1）。
  
  
  A2型β-酪氨酸激酶的起源和特征
  
  乳蛋白主要由乳清蛋白和氰钴胺组成。在母乳中，氰钴胺约占蛋白质含量的50%，而在牛奶中，其含量可达80%。GB 31638-2016《国家食品安全标准——酪蛋白》将氰钴胺定义为“通过酸、酶或膜分离工艺从牛奶和/或乳制品中获得的产物，由α、β、κ和γ及其同工酶的混合物组成”。母乳蛋白主要由β-氰钴胺组成，它是婴幼儿氨基酸、磷和钙的来源，并在胃中形成凝乳以进行消化。β-氰钴胺是主要的酪蛋白，约占酪蛋白总量的30%-40%。天然存在的β-氰钴胺素共有12种变体：A1、A2、A3、B、C、D、E、F、G、H1H2和I，其中A1和A2最为常见。β-氰钴胺素及其酶解产物具有多种营养益处，包括促进钙和锌的吸收。虽然A1是普通牛奶中主要的β-氰钴胺素，但A2也存在于羊奶和骆驼奶中。一杯250毫升的牛奶大约含有2克至3克β-氰钴胺素（见图​​2）。

研究表明，A2β-CN的氨基酸序列最为原始。目前在牛群中发现的A1β-CN变体是A2氨基酸序列第67位脯氨酸（Pro）突变为组氨酸（His）所致（见图3）。A1β-CN可在人体内经酶促水解生成7个氨基酸的β-酪啡肽（BCM-7），这是一种源自乳汁的生物活性阿片肽，可激活内源性阿片受体，从而产生生理反应。相比之下，A2β-CN很少水解生成内源性阿片肽。

流行病学研究已将BCM-7与某些疾病联系起来，包括增加1型糖尿病、心脏病、新生儿猝死、呼吸功能障碍、胃肠道疾病以及自闭症和精神分裂症等神经系统疾病的风险。然而，这种关联的程度仍需进一步验证。

乳制品中A2型β-酪蛋白的检测技术

目前国内外尚无A2乳制品的产品标准和检测方法标准。文献报道的相关方法标准和方法可以对β-酪蛋白进行定性和定量分析。

01 现有相关方法标准

（1）BJS 201915 含乳饮料及其乳原料中酪蛋白含量的测定。其原理是利用等电点沉淀法将样品溶液中的酪蛋白重新溶解，用胰蛋白酶进行酶解，加入同位素内标，用C18水柱分离，最后采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）和内标法进行定量分析。该方法可以测定四种酪蛋白亚型：αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的含量。

（2）T/CNHFA 003-2022 牛奶和乳制品中牛酪蛋白成分的定性测定。采用毛细管凝胶电泳法。

02 文献中报道的分析方法

可以概括为两类：一类是根据研究对象，分别分析奶牛基因型和最终产品；另一类是根据分析方法原理，分为定性分析和定量测定。

（1）基于研究对象

针对奶牛基因型：主要目的是选育A2型奶牛群并管理奶源。例如，PCR-限制性片段多态性（RFLP）、等位基因特异性PCR（AS-PCR）、TaqMan探针法和rhAmp技术可用于区分A1型奶牛、A1A2型奶牛和A2型奶牛，但难以监管或追踪加工过程和产品中可能发生的交叉污染或掺假。例如，Nguyen等人（Food Chemistry，2019，https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.125532）采用乙酸铵沉淀CN，用尿素缓冲液复溶，在Agilent Poroshell 120 EC18色谱柱上分离，并用UHPLC-HRMS（Q-Orbitrap）进行分析。该方法能够以高分析精度提供一系列β-酪蛋白变体的分子量信息，从而可以监测杂交奶牛所产牛奶中A2A2表型的频率。Nguyen等人的研究结果表明，A2A2奶牛的表型频率始终小于1，这表明没有发现仅产A2牛奶的奶牛品种。

对于液态奶和奶粉等最终产品，分析技术主要包括高效液相色谱法 (HPLC)、毛细管电泳、酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和蛋白质组学（即使用 MALDI-TOF、HPLC-MS 或 UHPLC-Orbitrap 等方法分析酶消化后的完整蛋白质或特征肽）。

（2）基于分析方法原理

定性分析包括毛细管凝胶电泳、ELISA 和 MALDI-TOF。

毛细管凝胶电泳：组标准 T/CNHFA 003-2022 牛奶和乳制品中牛酪蛋白成分的定性检测，可定性分析牛奶、山羊奶及其制品中的牛酪蛋白成分，最低检测限 (LOD) 为 1%（成分质量比）。

ELISA：Biosensis 生产的牛 A1β/A2β 酪蛋白 ELISA 检测试剂盒，检测范围为 6.25ng/mL 至 400ng/mL。

MALDI-TOF：Di Francesco L. 等人（Nutrients，2018，10，1238；doi：10.3390/nu10091238）利用该方法区分不同类型的奶粉。每种配方奶粉都有其独特的特性。从一种配方奶粉切换到另一种配方奶粉会暴露出特定的蛋白质组，从而能够识别掺假奶粉。

定量分析通常采用液相色谱法（LC）或液相色谱-质谱联用法（LC-MS）。样品预处理方法主要分为三类：

第一种方法是利用等电点沉淀法提取氰化物（CN），然后洗涤沉淀物进行检测。该方法所需试剂较少，可获得纯度较高的氰化物，但操作较为复杂。例如，前述方法标准BJS 201915采用等电点沉淀法处理样品，可测定四种同分异构体：αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN的含量。此外，由于该方法可同时测定多种氰化物同分异构体（包括β-CN）的含量，因此可与A2标准品联用，进一步定量A2 β-CN。

第二种方法是利用蛋白酶水解生成特征肽。该方法定量准确，但成本较高。Ehling S. 等人（《AOAC国际期刊》，104(6)，2021，1559–1566）使用胰蛋白酶对奶粉样品中的酪蛋白进行酶解，加入同位素内标，并使用Peptide BEH C18色谱柱进行分离。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）和内标法测定了β-酪蛋白（β-CN）和A1-β-酪蛋白（A1 β-CN）的含量。脱脂奶粉中A1-β-酪蛋白的定量限（LOQ）为0.01%。在实际应用中，该方法用于测定A2牛奶样品中A1-β-酪蛋白的含量（范围为0.26%至5.0%），并据此监测A2乳制品的质量。

第三种方法是利用尿素、盐酸胍、二硫苏糖醇、柠檬酸钠和乙二胺四乙酸二钠等试剂破坏酪蛋白胶束并打开蛋白质二硫键，从而使蛋白质变性并检测蛋白质含量。该处理方法能够完全溶解蛋白质并展开其空间结构。该方法操作简便但耗时较长，适用样品范围有限。例如，Lan Li等人（乳品科技，2022，45(2):18-23）采用液相色谱法测定超高温灭菌牛奶中的蛋白质含量。样品经盐酸胍、二硫苏糖醇和无机盐配制的缓冲溶液预处理后，采用液相色谱-紫外检测法进行分析，并用外标法进行定量。该方法可测定α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳清蛋白和β-乳球蛋白，检测限为0.01-0.02 g/100 mL。β-酪蛋白的保留时间为30.0 min。普通牛奶中的β-酪蛋白有三个峰（B型、A1型和A2型）。牛奶中A2型β-酪蛋白的保留时间为31.5 min。该方法适用于鉴别灭菌牛奶中是否含有A2型β-酪蛋白。研究发现，对生乳和由同一生乳加工而成的奶粉进行检测，发现A2型β-酪蛋白含量损失5%-10%。这可能是由于生乳在制粉过程中加热时发生的美拉德反应所致。蛋白质上的酪氨酸残基发生糖基化，阻碍了胰蛋白酶的切割，因为酪氨酸是胰蛋白酶的切割位点。然而，美拉德反应产生的糖基化酪氨酸钙与人体正常产生的糖蛋白不同，其生理功能可能降低或发生改变。因此，美拉德反应产生的糖基化β-酪氨酸钙是否应被归类为β-酪氨酸钙，还需要进一步探讨。

03 发展趋势及应用前景
鉴于色谱和质谱技术的广泛应用，未来乳制品中A2 β-CN检测的发展将集中在两个方面：
（1）方法学。基于蛋白质组学，色谱-质谱联用技术主要用于准确鉴定和定量蛋白质及其组成变化，进而准确定量乳制品中的A2 β-酪蛋白。可能面临的问题有：首先是可追溯性问题，因为目前尚无商业认证的β-酪蛋白或其特征肽标准样品或物质（CRM）；其次是准确性问题。如果采用特征肽进行定量，基于1摩尔目标蛋白水解1摩尔特征肽的定量原理，碱性胰蛋白酶无法完全酶解β-酪蛋白，这可能导致检测值低于实际值。
（2）监管需求。建立可靠、准确的定性和定量分析方法标准，并制定相应乳制品（如“A2牛奶”或“A2奶粉”）的产品标准，不仅能为乳制品质量监管提供技术支持，还能为食品质量安全监管提供执法依据。

随着消费者对乳制品质量要求的不断提高和市场需求的增长，建立高效、准确的乳制品中A2 β-酪蛋白定性定量分析技术，并制定相应的方法标准和产品标准，对于“A2牛奶”或“A2奶粉”等产品的真实性追溯、交叉混入或掺假监测、产品配方优化和质量控制至关重要，这不仅能保护消费者的权益，也能保障生产者的经济利益。